化學(xué)發(fā)光免疫分析平臺

發(fā)光是指分子或原子中的電子吸收能量后，由基態(tài)（較低能級）躍遷到激發(fā)態(tài)（較高能級），然后在返回到基態(tài)并釋放光子的過程。根據(jù)形成激發(fā)態(tài)分子的能量來源不同發(fā)光可以分為光照發(fā)光、生物發(fā)光、化學(xué)發(fā)光。

化學(xué)發(fā)光（chemiluminescence，CL）是指伴隨化學(xué)反應(yīng)過程所產(chǎn)生的光的發(fā)射現(xiàn)象。反應(yīng)體系中的某些物質(zhì)分子，如反應(yīng)物、中間體或者熒光物質(zhì)在進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)時，由于吸收了反應(yīng)時產(chǎn)生的化學(xué)能，使反應(yīng)產(chǎn)物分子激發(fā)至激發(fā)態(tài)，受激分子由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時，便發(fā)出一定波長的光。化學(xué)發(fā)光分析方法主要是依據(jù)化學(xué)發(fā)光檢測體系中待測物濃度與體系的化學(xué)發(fā)光強度在一定條件下呈線性定量關(guān)系的原理，利用儀器對體系化學(xué)發(fā)光強度進(jìn)行檢測，而確定待測物含量的一種痕量分析方法。

1977年，Halman等將化學(xué)發(fā)光與抗原抗體免疫反應(yīng)相結(jié)合，創(chuàng)建了化學(xué)發(fā)光免疫分析方法（chemiluminescent immunoassay，CLIA），相較于傳統(tǒng)免疫技術(shù)（放射免疫技術(shù)、酶免疫技術(shù)、熒光免疫技術(shù)等），CLIA具有自動化程度高、特異性好、精確度高、檢測范圍廣等優(yōu)勢。

化學(xué)發(fā)光免疫分析方法類型及其原理

CLIA包含兩個部分，即化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)和免疫反應(yīng)系統(tǒng)?；瘜W(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)是利用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)經(jīng)催化劑的催化和氧化劑的氧化，形成一個激發(fā)態(tài)的中間體，當(dāng)這種激發(fā)態(tài)中間體回到穩(wěn)定的基態(tài)時，同時發(fā)射出光子(hν)利用發(fā)光信號測量儀器測量光量子產(chǎn)額。免疫反應(yīng)系統(tǒng)是將發(fā)光物質(zhì)(在反應(yīng)劑激發(fā)下生成激發(fā)態(tài)中間體)直接標(biāo)記在抗原或抗體上，或酶作用于發(fā)光底物?；瘜W(xué)檢測系統(tǒng)通過光電信號檢測儀檢測發(fā)光強度，最后通過化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物與發(fā)光強度的關(guān)系確定被測物的含量。

CLIA根據(jù)標(biāo)記物的不同可分為三大類，即直接化學(xué)發(fā)光免疫分析、酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析和電化學(xué)發(fā)光免疫分析。

直接化學(xué)發(fā)光

化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗體或抗原的免疫測定方法稱為化學(xué)發(fā)光免疫分析。直接化學(xué)發(fā)光劑在發(fā)光免疫分析過程中不需要酶的催化作用，直接參與發(fā)光反應(yīng)，他們在化學(xué)結(jié)構(gòu)上有產(chǎn)生發(fā)光的特有基團(tuán)，可直接標(biāo)記抗原或抗體，目前常見的直接化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物主要有吖啶酯類化學(xué)發(fā)光劑。

用吖啶酯直接標(biāo)記抗體，與待測標(biāo)本中相應(yīng)的抗原發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原-吖啶酯標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時只需加入氧化劑（H₂0₂）和NaOH使成堿性環(huán)境，吖啶酯即可在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光。由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時間內(nèi)所產(chǎn)生的光子能，這部分光的積分與待測抗原的量成正比，可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出待測抗原的含量。

直接化學(xué)發(fā)光速度快、試劑穩(wěn)定性好，但靈敏度略低于酶促發(fā)光。

酶促化學(xué)發(fā)光

酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescentenzymeimmunoassay，CLELA)是以酶標(biāo)記抗原或抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)，免疫反應(yīng)復(fù)合物上的酶再作用于發(fā)光底物，在信號試劑作用下發(fā)光，用發(fā)光信號測定儀進(jìn)行發(fā)光測定，酶的濃度決定了化學(xué)發(fā)光的強度。辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)為化學(xué)發(fā)光酶免疫分析常用的標(biāo)記酶，發(fā)光底物以魯米諾、AMPPD為代表。

魯米諾+HRP發(fā)光體系

HRP-CLEIA體系具有發(fā)光時間短(幾秒內(nèi)瞬時閃光)，發(fā)光強度低、不易測量等缺點，為了解決這一問題，通常在發(fā)光系統(tǒng)中加入發(fā)光增強劑。發(fā)光增強劑主要作用為放大光輸出，增強光信號，提高發(fā)光持續(xù)性，從而提高分析靈敏度和可重復(fù)性。

該分析系統(tǒng)采用辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗體，在與反應(yīng)體系中的待測標(biāo)本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶（HRP）標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時加入魯米諾發(fā)光劑、H₂O₂和化學(xué)發(fā)光增強劑使產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。

ALP+AMPPD發(fā)光體系

堿性磷酸酶(ALP)和1，2-二氧環(huán)己烷構(gòu)成的發(fā)光體系是目前最重要、最靈敏的化學(xué)發(fā)光體系，其中最具代表性的是ALP-AMPPD發(fā)光體系。該反應(yīng)體系以堿性磷酸酶標(biāo)記抗體，在與反應(yīng)體系中的待測標(biāo)本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時加入AMPPD發(fā)光劑，堿性磷酸酶使AMPPD脫去磷酸根基團(tuán)而發(fā)光。

電化學(xué)發(fā)光免疫分析

在電極上施加一定的電壓或電流時，在電極電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物之間或電極反應(yīng)產(chǎn)物與溶液中某種組分之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生激發(fā)態(tài)，當(dāng)激發(fā)態(tài)躍遷回基態(tài)時放出能量，此過程即為電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)。電化學(xué)發(fā)光免疫分析(electrochemiluminescenceimmunoassay，ECLIA)是以電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體，以三丙胺(TPA)為電子供體，在電場中因電子轉(zhuǎn)移而發(fā)生特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，它包括電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個過程。

在電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)中，磁性微粒為固相載體包被抗體，用三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體，在反應(yīng)體系內(nèi)待測標(biāo)本與相應(yīng)的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成磁性微粒包被抗體-待測抗原-三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時將上述復(fù)合物吸入流動室，同時引入TPA緩沖液。當(dāng)磁性微粒流經(jīng)電極表面時，被安裝在電極下面的電磁鐵吸住，而未結(jié)合的標(biāo)記抗體和標(biāo)本被緩沖液沖走。與此同時電極加壓，啟動電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，使三聯(lián)吡啶釕和TPA在電極表面進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光，光的強度與待測抗原濃度成正比。

三種化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的比較

化學(xué)發(fā)光、時間分辨熒光、酶免疫分析對比

臨床應(yīng)用

CLIA具有特異性強、靈敏度高、準(zhǔn)確、操作簡單、快速等優(yōu)點，它將化學(xué)分析方法和免疫學(xué)分析方法的優(yōu)點融合了起來，已經(jīng)被廣泛用于生命科學(xué)、環(huán)境科學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)和生理學(xué)等領(lǐng)域。常見的臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用有：

甲狀腺激素檢測；
生殖激素檢測；
垂體激素和皮質(zhì)激素檢測；
貧血因子檢測；
腫瘤標(biāo)志物檢測；
感染性標(biāo)志物檢測；
感染性疾?。?br /> 糖尿病、胰島素、血清C-肽、血漿胰高糖素等；
心臟標(biāo)志物檢測；
病毒標(biāo)志物檢測；
過敏性疾??；
治療藥物檢測；

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• CRP蛋白
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